Nf01_2011 - Gebhardt, Christoph

Verschiedene Techniken zur Herstellung von in vitro-Lenkungssubstraten für retinale Axone. A) Homogene Substrate (rot) unterschiedlicher Zellmembran-Konzentrationen zur Untersuchung des differenziellen Auswachsverhaltens von retinalen Axonen (Hansen et al. 2004). B) Binäre Substrate aus abwechselnden Streifen anteriorer und posteriorer Membranen (Streifenassay) zur Analyse des Entscheidungsverhaltens von retinalen Axonen (Walter et al. 1987a). C) Gradierte Streifensubstrate aus tektalen Membranen für die Analyse des Stoppverhaltens retinaler Axone (Baier und Bonhoeffer 1992; Rosentreter et al. 1998). D) Modifizierte Streifenassays, bei denen aufgereinigte Lenkungsproteine anstatt tektalen Membranen verwendet werden. Dafür wird eine Silikonmatrix mit durch Stege getrennten 90μm-Kanälen auf ein Deckglas oder eine Plastikoberfläche gelegt. Protein kann dann durch Adsorption aus den Kanälen (links, Vielmetter et al. 1990) oder durch Drucken des Proteins mit den Stegen auf die Oberfläche gebracht werden (rechts, Gebhardt et al. 2008). E) Für hoch präzise, geometrische Verteilungen von Lenkungsmolekülen kann micro-contact printing (μCP) verwendet werden (von Philipsborn et al. 2006). Dafür wird ein Silikonwafer hergestellt, in den mittels Elektronenstrahllithografie das gewünschte Muster eingebrannt wurde. Dann wird ein PDMS-Würfel homogen mit Protein bedeckt und direkt auf den Wafer gelegt. Nach dem Entfernen ist das Muster des Wafers auf den PDMS-Würfel übertragen, welcher dann als Stempel auf eine Deckglas- oder Plastikoberfläche gedrückt wird. Nach dem Drucken wird die freie Oberfläche mit Laminin (weiß) überschichtet. Das hier dargestellte Muster ist ein Gradient bestehend aus Linien, die mit einer konstanten Proteinkonzentration hergestellt wurden, aber in Linienstärke und Linienabstand variieren. F) Die Herstellung von Gegengradienten aus ephrin-As (rot) und EphAs (blau) mit microfluidic networks. Diese können dazu benutzt werden, um ephrin-A- und EphA-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen auf einen PDMS-Würfel zu übertragen, ohne dass sich diese vermischen. In einem anschließenden contact printing-Schritt können die Proteine dann auf eine Plastik- oder Glasoberfläche aufgebracht werden. Dadurch können stufenförmige substratgebundene Gegengradienten der Lenkungsmoleküle hergestellt werden.

Download